IFN诱导技术

1.至今没有真正的抗病毒药物

病毒性疾病让养猪业蒙受了巨大损失，养猪人谈病毒变色，应运而生了抗病毒药物的研究热。翻开满天下飞舞的药品推介书、仿单，映入眼帘的有如下抗病毒药在猪病临床的浊流中飘浮：转移因子、集落刺激因子、白细胞介素、免疫核糖核酸，植物血凝素等等，它们都具有提高免疫功能与抗病毒的作用，但是它们同样不是真正的抗病毒药，同时还有许多未成熟技术环节有待完善，离兽医临床应用有遥远的路要走。它们要么半衰期过短，不持续静脉给药不能凑效；要么有物种种属特异性或者病谱特异性，普遍应用受到限制；要么有耐受性，反复应用剂量必须不断加大；要么价格不菲，兽医临床根本不能使用（参阅《跟芦老师学养猪系统控制技术》·第三章·第六节）。

至于被某些人们炒作抗病毒新秀的反义寡核苷酸又是如何呢？

反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ason）是指进行了某些化学修饰的短链核酸 （约15-25个核苷酸组成），它的碱基顺序排列与特定的靶标RNA序列互补，进入细胞后，按照watsonCrick碱基互补配对的原则与靶序列形成双链结构。结合后通过三种不同的机制影响靶标基因的表达。第一，ason与引物前体结合，阻止正常引物的产生，使DNA的复制不能进行；第二ason与mRNA5´ 结合，形成类似转录终止信号的Ⅱ级结构，使转录中止，水平低下；第三，ason与mRNA 的SD序列和/或编码起始区结合，直接抑制翻译;ason还可与mRNA非编码区结合，使mRNA分子构象发生改变而不能与核糖体结合，从而间接抑制翻译。

很清楚ason是一种影响靶细胞基因功能而对抗病毒的基因治疗药物，但是ason的临床应用存在诸多有待解决的问题。

第一，ason的作用具有双重性。ason与mRNA结合形成的mRNAⅡ级结构可抑制其翻译，也可促进基因的表达，如何克服其双重性是临床应用中的一道门槛，否则病毒的表达可能更强烈。

第二,ason具有专一性。众所周知，不同病毒基因序列不同，每一种ason的碱基序列必须要与特定靶标的RNA序列互补，因此，不可能有一种ason能针对多种病毒来设计，不可能具有广谱性，这无疑限制了应用中的实用性。

第三、ason必须修饰极化。裸露的ason必须要进入靶细胞与同源基因结合才能发挥作用。这种进入细胞的过程是一种内化过程，效率很低，要使之成为高效主动吸收过程一定要将ason极化，若缺乏此修饰过程，ason的功效会大为降低。

第四，ason具有明显的剂量依赖性。即或有成熟的ason产品，随着连续应用，其剂量必须逐步增加，否则达不到疗效，这种连续应用中成本的递增让养猪人望而生畏。

第五，ason会被酶解，在体内难以达到有效浓度。

第六，对非靶细胞有副作用。

不难看出，至今难有真正抗病毒药物面市，而既廉价又实用有效的IFN诱导技术自然被兽医临床工作者推到前台。

2.干扰素（interferon，IFN）的概况

1957年Isaacs在研究紫外线照射对流感病毒的鸡胚绒毛尿膜组织培养的影响时发现，培养数小时后，组织培养液中虽然没有病毒颗粒，却含有一种可溶性蛋白质，能抑制活流感病毒的繁殖，这种蛋白质称之为干扰素。以后观察到很多的细胞培养、鸡胚或者实验动物在感染任何一种动物病毒，无论是DNA病毒还是RNA病毒，都有IFN产生，可见IFN的产生是需要病毒等诱生剂诱生的。

IFN的理化特性如下：

1.不能透析

2.用100,000xg离心4小时不沉淀

3.用胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶处理可以灭活，但DNA酶、RNA酶、脂酶、受体破坏酶不能将其灭活。

4.PH2-10都很稳定，特别是是在PH2可抵抗很久时间，4℃时稳定，50℃时可抵抗一小时，70℃1小时活力下降1/2。

5.IFN蛋白质中含有所有氨基酸，但不含核酸，单体分子量在12000-19000之间

6.没有毒性；抗原性很弱，应用同种动物的IFN一般不引起免疫应答，不为病毒抗血清中和，不能自我复制。

IFN对细胞表面的IFN受体有高度亲和力，IFN与受体的相互作用可激发靶细胞合成新的mRNA，产生多种效应蛋白,发挥抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节的作用，故尔可以认为IFN是细胞基因组自我稳定的反应产物，是除免疫系统外的另一防御系统。

IFN是非特异性防卫因子，并不能直接作用于病毒颗粒，但可以保护敏感的宿主细胞抵抗病毒感染，即能抑制病毒在寄主细胞内复制。这种抑制作用没有特异性，抑制病毒的范围甚广，即对多种病毒有抑制作用；在病毒感染的早期，机体尚未产生特异性抗体之前IFN就产生了，因此，IFN在抗病毒感染中起重要的作用。

IFN通过以下途径发挥抗病毒的作用。一是，IFN与特异性受体结合，活化细胞膜腺苷环化酶，促使cAMP（环腺苷-磷酸）形成，激活细胞内抗病毒作用，产生以下列抗病毒物质：出现寡核苷酸组成的2’-5’A系统，进而活化2’-5’A依赖RNA酶，从而降解病毒RNA；产生蛋白激酶（PKi），Pki磷酸化后可阻断病毒蛋白质的合成；导致磷酸二脂酶（2’-PDi）增多，抑制病毒蛋白质的翻译。二是，IFN可抑制mRNA帽的甲醛化与氨基酸的酯化，干扰病毒蛋白质的合成。三是，增强细胞毒性细胞，包括细胞毒性T细胞（CTL）、吞噬细胞、K细胞与NK细胞（自然杀伤细胞）的功能，促进淋巴因子的释放，有利于机体清除病毒与病毒感染的细胞。四是增加细胞表面抗原的表述，提高了免疫反应的强度。

3.IFN的诱生（诱导）

机体内只有很少的细胞可以自发产生低浓度的IFN，因此，IFN的产生一般需经诱生。这些可以激发靶细胞产生IFN 的物质称之为诱生剂或诱导剂。诱导剂分为两类，一类为A级诱导剂，即病毒核酸(双股RNA诱导最强)与人工合成的dsRNA，其诱导力强，无论是在活体内或离体培养细胞均可产生高浓度IFN；另一类为B级诱导剂，仅限于在动物体内产生IFN，如布氏杆菌，立克次氏体，支原体，分枝杆菌，等细胞内感染的微生物，脂多糖等微生物代谢产物，环己亚胺，卡那霉素等低分子量物质，促有丝分裂原等 。

IFN的诱生分为两个阶段，第一为诱导期，约为1-8小时，首先是诱导剂与细胞膜接触，激发抑制状态的IFN基因去抑制；第二期 为产生期，包括IFNmRNA转录，蛋白质的翻译与IFN的分泌，任何诱导剂其诱导IFN产生的曲线基本相似，呈抛物曲线，但各期的长短则因细胞和诱导剂的不同而不同。著者从临床实践中体会到，以猪瘟疫苗病毒和鸡新生疫苗病毒诱导产生IFN的持续最长，约三周之久。

诱导IFN的过程中有规律可循，并对临床应用有指导意义。

1.IFN的产生与释放在细胞首次感染病毒后持续20-50小时，其后不再产生IFN，即使再感染病毒也不行，此期可称之“不应期”约持续72小时，因此第二次应用IFN诱导剂必须在第一次应用后72至120小时进行。

2.首次应用IFN诱导剂只能产生低浓度IFN，第二次应用才能产生高浓度IFN。

3.IFN产生的量与诱导剂的量在一定范围内呈正比，因此，要产生高浓度IFN，必须用大剂量诱导剂

4.灭活病毒的诱导作用比活病毒强

5.吮乳幼畜产生IFN比成年动物少得多。

6.热应激有碍IFN的产生，甚至不产生IFN

4.兽医临床上为什么不直接用IFN，而是采用IFN诱导技术抗病毒感染

IFN的半衰期短，必须每天或隔天给药，价格亦不菲，以人类重组IFNα-2b治疗慢性活动性乙型肝炎为例，每日皮下注射200万-500万国际单位或隔日注射1000万国际单位。300万单位的普通IFN的价格在50-80无，至少须隔日一针，而长效干扰素的价格在1200-1500元，一周一针，如此高昂的费用是不可能用于兽医临床的。

但是，兽医有最优秀的 、廉价的A级INF诱导剂 ——猪瘟弱毒疫苗病毒与鸡新城疫疫苗病毒。据著者临床观察产生IFN浓度高，持续期长，没有任何副作用，适于所有的病毒感染。

5.猪病防治中应用IFN诱导的重大意义

防治病毒性疾病是猪病防治中的大难题，著者通过几十年的探索，不仅成功应用IFN诱导技术治疗多种病毒性疾病，而且可以预防病毒性疾病，净化病毒性疾病，并且形成了一整套技术应用方案。其IFN诱导技术临床意义如下：

5.1.治疗PRRS、PR、CSF、SI等病毒性疾病，

当发生上述病毒性疾病时，除CSF可以用活的猪瘟疫苗作为诱导剂外，其它病毒性疾病均用死疫苗。

5.2.可作为净化病毒性疾病的手段之一

净化工作无非是接种疫苗，淘汰阳性猪，但是没有一种检测手段是有100%特异性，难保阳性个体漏检，而IFN诱导技术可以在多次应用前提下，使阳性转阴。针对PRRS自然阳性猪场，著者每两个月对全群母猪实施INF诱导一疗程，大半年后血检居然检不出PRRS阳性猪。

5.3.可以阻止病毒病的发生

不少猪场发病集中于某一阶段或某两个阶段，著者在发病阶段的前7天对相关猪群进行全群IFN诱导，每每可以阻止疫病的发生。结合清除环境中的诱因，效果更好。

5.4.为模糊治疗增加了措施

猪病的临床症状少有诊断价值，众多养猪人又不懂病理剖检，只能靠症状作出模糊诊断，估计着用抗菌药物治疗，但效果常不理想，除了霉菌毒素损伤肝肾功能影响抗菌药疗效外，未能控制病毒感染也是重要的原因。而IFN诱导技术可以克服此等不足，有效对抗病毒感染，从而提高了模糊治疗的疗效。在著者指导下，不少被判无救的猪场获得了重生。

6.IFN诱导技术的临床应用

6.1.抗病毒感染

除猪瘟病毒感染外，一律用灭活猪瘟普通细胞疫苗，即将猪瘟疫苗放在沸水中10分钟左右，或放在阳光直射下数小时，或放置于紫外灯下50cm处数小时便是灭活猪瘟疫苗。奶猪20头份，保育猪 40头份，中大猪 60头份，母猪80—100头份肌注 ，72小时后重复肌注一次，若采用鸡新城疫Ⅰ系疫苗或Ⅳ系疫苗同样灭活，剂量为奶猪40羽，保育猪80羽，中大猪 160羽，母猪200羽。

若是治疗或预防TGE或PED，则改为交巢穴注射，剂量同上。

72小时后重复应用一次极为重要，只有第二次给于诱导才能产生高浓度的IFN，才能有效抗病毒感染，才能是一个疗程

6.2.用于净化PRRS和PCV-2

净化的对象主要是种猪，包括母猪和公猪。每2-3个月对母猪和公猪做一个疗程的IFN诱导，须持续半年至一年以上。灭活猪瘟疫苗的超大剂量的接种的安全问题是大家关心的，著者与同仁在近百万头母猪的应用证明，只要按操作规程实施，妊娠任何阶段的母猪无一头流产，死胎率未见上升，也不会早产。IFN的诱导对母猪是安全的，但是一定是灭活疫苗。此举可防止PRRSV的垂直传播。

6.3.预防保育猪发生PRRS与PCV-2，或预防PRRSV与PCV-2干扰CSF疫苗的接种效价

保育猪，中猪之所以发生PRRS和PCV-2，是由于母猪带毒的结果，因此，控制的关键环节在于做好母猪的清毒工作。在做IFN诱导净化的猪场，应将每2-3月一疗程的IFN的诱导安排一次在产前一周应用，以保证哺乳期不排毒感染奶猪，若为28日龄断奶，可在产后15-18天后再做一疗程。

如果在完成上述对母猪的疗程后，仍不放心，可在20日龄奶猪实施IFN诱导。须要注意的是，猪瘟疫苗的首免要放置在45日龄实施，过早接种会干扰接种效价。

6.4.预防中大猪阶段发生病毒性疾病

可在发病阶段前一周实施一疗程的IFN诱导，必要时三周后重复一次。

6.5.预防FMD感染

著者只做了一个猪场，在FMD发生后立即对未发病的数栏猪（约60头）做IFN诱导，未做IFN诱导的同舍猪很快全发生FMD，但过20余天后，做过IFN诱导的猪也发生了FMD。试验结果表明，IFN诱导产生的IFN可以持续三周，比直接IFN给药持续期长得多，可以延缓FMDV的感染与发病；然而这是在同舍病猪没有清除、隔离的情况下的试验，其消毒工作也并不尽如人意。如果，封锁、隔离、消毒工作做的到位，环境中病毒富集量小，就可能不再发病；如果，全群都做IFN诱导，延缓的三周为实施疫病防制预案赢得了宝贵的时间。所以说，IFN诱导在防止FMD流行中的作用仍值得深入探索。

六.实施IFN诱导技术中其它注意事项

1.IFN是机体的非特异性防卫机制之一，机体的健康状况影响IFN的诱生量。IFN诱导技术同样是疫病系统控制技术的一个组成部分，如果没有控制霉菌毒素的危害，IFN诱导的效果就会有差异，当肝脏受损严重时，甚至诱导失败，无效。

2.应激亦会影响IFN诱导的效果，特别是热应激影响最严重，使母猪，肥猪的诱导效果不佳。如果夏季发生疫病需要用IFN诱导技术时，一定要规避或减轻热应激。

3.奶猪的免疫功能尚未发育完善，应用IFN诱导技术效果稍差一些，因此，防止奶猪的病毒性疾病，仍须从母猪的IFN诱导做起，效果更好些。

4.除确认为猪瘟的病例可以用活的猪瘟疫苗做IFN诱导外，其它情况一律不可用活疫苗，只可用灭活疫苗做IFN诱导，如此，不仅IFN诱生量大，而且可以避免超大剂量的活疫苗可能引发的争议。

5.以猪瘟疫苗的普通细胞苗做诱导剂最好，坊间认为又以广东永顺的普通细胞苗的诱导效果最好。

6.IFN诱导后的20天内不宜接种其它活疫苗。